КАКОВЫ ИЗЫСКАНИЯ... Диссертация: Общие принципы ДНК-идентификации личности на основе генетического штрих-кодированияГод 2003 Автор научной работы: Гарафутдинов, Равиль Ринатович Ученая cтепень: кандидат биологических наук Место защиты диссертации: Б.м. Специальность: Молекулярная биология Количество cтраниц: 144 Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гарафутдинов, Равиль Ринатович ВВЕДЕНИЕ. • ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. ДНК-идентификация личности 1.1.1. Идентификация личности. 1.1.2. ДНК-идентификация личности на основе вариабельного числа тандемных повторов VNTR-локусов. 1.1.3. ДНК-идентификация личности на основе коротких тандемных повторов STR-локусов. 1.1.4. ДНК-идентификация личности на основе однонуклеотидного полиморфизма ДНК. 1.2. Методы обнаружения однонуклеотидных замен. 1.2.1. Однонуклеотидное удлинение праймера. 1.2.2. Аллель-специфичная ПЦР. 1.2.3. Анализ снипов путем определения температур плавления дуплексов. 1.2.4. Инвазивное расщепление. 1.2.5. Методы анализа снипов, основанные на лигировании. 1.2.6. Аллель-специфичная гибридизация. 1.2.7. Анализ однонуклеотидных замен с помощью ДНК-чипов. 1.2.8. Изготовление ДНК-чипов. ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1. Краткая характеристика объектов исследований. 2.2. Выделение геномной ДНК человека. 2.3. Синтез и очистка олигодезоксирибонуклеотидов. 2.4. Фосфорилирование олигонуклеотидов. 4 2.5. Полимеразная цепная реакция - ПЦР. ш 2.6. Полимеразная цепная реакция в реальном времени - ПЦР 2.7. Лигазная цепная реакция в реальном времени - ЛЦР-РВ. 2.8. Аналитический гель-электрофорез ДНК. 2.9. Технология циклирующей пробы - ТЦП. 2.10. Иммобилизация олигонуклеотидов на стекло. 2.11. Объединение циклической амплификации по типу катящегося кольца и технологии циклирующей пробы. 2.12. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 2.13. Реактивы и материалы. 2.14. Составы использованных стандартных растворов. ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Принципы генетического штрих-кодирования. 3.2. Методы детекции однонуклеотидных замен 3.2.1. Лигазная цепная реакция в режиме реального времени. 3.2.2. Технология циклирующей пробы. 3.2.3. ТЦП в чиповом варианте. 3.2.4. Объединение циклической амплификации по типу катящегося кольца и технологии циклирующей пробы с рибобиконом. 3.3. Базы данных по генетическим штрих-кодам населения и их программное сопровождение. Введение диссертации (часть автореферата) На тему "Новые методы детекции однонуклеотидных замен и общие принципы ДНК-идентификации личности на основе генетического штрих-кодирования" Актуальность темы. В настоящее время человечество стоит перед необходимостью однозначно идентифицировать любого человека по только ему свойственным биологическим признакам вследствие высокого уровня криминалитета, терроризма, происходящих природных и техногенных катастроф, приводящих зачастую к многочисленным, иногда неподдающимся опознанию жертвам. Начало ДНК-идентификации личности, которая насчитывает уже более двух десятилетий, было положено работами  А. Джеффриса, впервые предложившего использовать высокополиморфные локусы для генетической паспортизации человека [Jeffreys et al., 1985; Gill et al., 1985]. На основе минисателлитного участка, присутствующего в первом интроне миоглобинового гена, ими были созданы гибридизационные пробы 33.15 и 33.6, получившие впоследствии название «пробы Джеффриса». Помимо них для ДНК-идентификации личности применялись и другие гипервариабельные гибридизационные пробы, в том числе основанные на тандемных повторах, локализованных в гене белка 3 фага М13 [Рысков и др., 1988; Иванов и др., 1989]. Однако сопоставление электрофоретических картин полиморфизма ДНК разных людей велось практически по принципу похоже - не похоже», что сильно затрудняло их сравнение. Несмотря на определенные трудности в использовании проб, относящихся к VNTR-( локусам (Variable Number of Tandem Repeats), они широко использовались в криминалистике на протяжении целого десятилетия и при этом сыграли значительную роль в установлении виновности подозреваемых. В начале 90-х гг. прошлого столетия на смену проб к VNTR-локусам пришел анализ STR-локусов (Short Tandem Repeats), отличающихся от первых более короткими, как правило, 2-5 нуклеотидными повторяющимися мотивами [Edwards et al., 1991]. Поскольку нередки случаи обнаружения на месте преступления биологических следов в крайне малых количествах и подчас содержащих ДНК в деградированном состоянии, не позволяющем провести анализ VNTR-полиморфизма, то одним из главных преимуществ использования STR-локусов стало то, что для их анализа требовалось значительно меньшее количество ДНК. В последние годы наблюдается тенденция использования в ДНК-идентификации личности так называемых miniSTR-локусов, характеризующихся сближенным расположением праймеров к непосредственно микросателлитным повторам, что способствует повышению точности анализов при работе с сильно фрагментированной ДНК [Butler et al., 2003; Coble, Butler, 2005]. Серьезным недостатком использования для ДНК-идентификации STR-локусов была и остается их сильная зависимость от расовых и национальных особенностей, из-за которой в одной только Великобритании существует 3 разных базы данных, где сведения о людях хранятся сообразно их расовым признакам. В одной из них содержатся сведения о европейцах, в другой - об азиатах, включая индусов, в третьей собраны данные о выходцах из стран Африки и Карибского бассейна. При этом базы данных не могут быть сравнены между собой. Следовательно, для определения принадлежности неизвестных ДНК-следов, оставленных на месте преступления, экспертам необходимо проводить несколько анализов, используя разные коммерческие наборы с соответствующими STR-локусами. Это свидетельствует в пользу необходимости замены используемых маркерных признаков на основе STR-локусов другими, в гораздо меньшей степени зависимыми от расовой и национальной принадлежности носителей ДНК. В настоящее время на роль новых маркеров - маркеров третьего поколения, претендуют однонуклеотидные замены [Budowle et al., 2005; Divne, Allen, 2005; Dixon et al., 2005; Vallone et al., 2005]. Они теоретически могут обеспечить уникальность каждого индивидуума при ДНК-идентификации [Gill, 2001] и пригодны для создания на их основе истинно цифровых баз данных с возможностью поиска и сравнения по ним. В сегодняшний день анализ снипов ведется разными методами, однако разработка новых более производительных методов продолжается. Серьезное внимание уделяется подходам, которые потенциально могут быть переведены в более производительный и дешевый биочиповый формат. Обилие методов анализа снипов свидетельствует о том, что не предложен метод, удовлетворяющий всем требованиям. Цель и задачи исследования. Целью исследования явилась разработка принципов однозначной ДНК-идентификации личности и новых методов обнаружения однонуклеотидного полиморфизма в режиме реального времени. В задачи исследования входило: 1) сформулировать принципы выбора генетических маркеров, способных обеспечить индивидуальность каждого члена общества; 2) разработать принципы генетического штрих-кодирования на основе индивидуального полиморфизма ДНК человека; 3) создать прообраз банка данных по генетическим штрих-кодам людей и его программное сопровождение; 4) разработать новые методы обнаружения однонуклеотидных замен в режиме реального времени с возможностью их перевода в ДНК-чиповый формат. Научная новизна и практическая ценность. Впервые предложен способ генетического штрих-кодирования человека, основанный на индивидуальном полиморфизме однонуклеотидных замен, теоретически обеспечивающий однозначную ДНК-идентификацию личности. Впервые созданы прообразы банка данных по генетическим штрих-кодам людей, написаны компьютерные программы для ввода данных, их поиска и сравнительного анализа. Лигазная цепная реакция (ЛЦР) амплификации фрагментов ДНК преобразована для ее проведения в режиме реального времени. Предложены новые методы детекции однонуклеотидных замен, основанные на лигазной цепной реакции, на объединении технологии циклирующей пробы с молекулярным рибонуклеотидным сигнальным огнем (рибобиконом), а также на объединении двух последних с изотермической амплификацией по типу «катящегося кольца». Для последнего подхода предложен более экономичный вариант за счет применения на стадии лигирования дополнительного короткого олигонуклеотида с дискриминирующими нуклеотидами на З'-конце, что позволяет более длинный олигонуклеотид сделать общим для детекции всех вариантов нуклеотидов в конкретном снипе. Показана принципиальная возможность перевода объединенной технологии поиска однонуклеотидных замен с помощью циклирующей пробы и рибобикона в более удобный для массовых анализов ДНК-чиповый формат. Практическая значимость работы заключается в разработке генетического штрих-кода человека, который может стать дополнительной характеристикой каждого индивидуума, упорядочить учет граждан, помочь правоохранительным органам в борьбе с преступностью. Социальная значимость генетических штрих-кодов и баз данных по ним заключается в однозначной идентификации тел погибших без привлечения для анализа ДНК родственников. Предложенные варианты лигазной цепной реакции в реальном времени применимы также для целей общей высокочувствительной и специфичной ДНК-диагностики. Апробация работы♦ Материалы диссертации были представлены на III съезде ВОГиС "Генетика в XXI веке" (Москва, 2004), на II и III съездах Общества биотехнологов России (Москва, 2004, 2005), на международном симпозиуме "Трансгенные растения и проблемы биобезопасности" (Москва, 2004), на VI Международном форуме "Высокие технологии XXI века" (Москва, 2005), на 2-ой международной конференции "Биотехнология-Биомедицина-Окружающая среда" (Пущино, 2005), на республиканской научно-практической конференции «Успехи интеграции академической и вузовской науки по химическим специальностям» (Уфа, 2006). Конкурсная поддержка работы. Исследования были выполнены в соответствии с Федеральной целевой программой «Интеграция науки и высшего образования России на 2002-2006 гг.», с Научной программой Министерства науки и высшего образования РФ «Развитие научного потенциала высшей школы», в рамках Программы государственной поддержки ведущих научных школ РФ-НШ-2217.2003.4 и НШ-1003.2006.4 и Государственных контрактов ФЦНТП №№ 02.438.11.7003 и 02.445.11.7018. Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 234 работы отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 144 страницах, содержит 29 рисунков и 4 таблицы. Заключение диссертации по теме "Молекулярная биология", Гарафутдинов, Равиль Ринатович ВЫВОДЫ: 1. Предложен новый способ ДНК-идентификации личности, основанный на разработанном нами принципе генетического штрих-кодирования. В основу универсального генетического штрих-кода человека положены четырехаллельные снипы, локализованные в высокополиморфных аутосомных локусах. 2. Для четырехаллельных снипов предложен оригинальный способ оцифровки четверки нуклеотидов ACGT, где в бинарном формате наличие нуклеотидов обозначено «1», отсутствие - «О»; 10 возможных комбинаций гомозиготных и гетерозиготных состояний нуклеотидов в снипах обозначены следующим образом: А и А - 1000, С и С - 0100, G и G - 0010, Т и Т - 0001, А и С - 1100, А и G - 1010, А и Т - 1001, С и G -0110, С и Т-0101, G и Т-0011. 3. Разработанный генетический штрих-код условного человека, несущего в 24 снипах набор нуклеотидов СС AC GT СС СС GG ТТ GG СС АА CG GG СС AC GT СТ АС ТТ АА GG ТТ AT AC AT, в бинарном формате имеет вид: 0100110000110100010000100001001001001000011000100 10011000011010111000001100000100001100111001001, в гексадеци-мальном формате - 4С34421248624С35С18119С9, в графическом формате-II III lllllilll III I lllll. 4. Создан прообраз банка данных по генетическим штрих-кодам, для которого написаны: а) компьютерная программа по переводу результатов выявления нуклеотидов в снипах в бинарный, гексадецимальный и графический форматы; б) компьютерная программа сравнительного анализа вновь полученных генетических штрих-кодов с уже имеющимися в банке данных. 5. Разработан новый метод анализа однонуклеотидных замен с помощью лигазной цепной реакции, преобразованной нами в режим реального времени. Показана возможность применения лигазной цепной реакции в реальном времени для целей общей высокочувствительной и специфичной ДНК-диагностики. 6. Разработан новый метод анализа однонуклеотидных замен с помощью объединения технологий циклирующей пробы и молекулярного рибонуклеотидного сигнального огня (рибобикона) и показана принципиальная возможность перевода его в более производительный ДНК-чиповый формат. 7. Разработан новый более экономичный метод анализа однонуклеотидных замен с помощью объединения технологий циклирующей пробы, рибобикона и изотермической амплификации по типу катящегося кольца с применением на стадии лигирования дополнительного короткого олигонуклеотида с дискриминирующим нуклеотидом на 3-конце. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Насчитывающая уже более 20 лет ДНК-идентификация личности прочно вошла в нашу жизнь, что вполне закономерно и объяснимо. Человечество не становится добропорядочнее, законопослушнее, миролюбивее: случаются военные конфликты, возрастает уровень терроризма и преступности. Происходят пожары, техногенные катастрофы, сопровождаемые людскими жертвами, Планета преподносит сюрпризы в виде стихийных бедствий и катастроф. В связи с этим часто возникают случаи, требующие опознания погибших не визуально, а с помощью сохраняющихся идентификаторов, которыми могут служить молекулы ДНК. Можно неутешительно прогнозировать, что количество ДНК-анализов в будущем будет расти. Прошедшие два десятилетия ДНК-идентификации уже убедительно доказали уникальность и пригодность молекулы ДНК для решения подобных задач. Однако в настоящее время необходимо разработать подходы, позволяющие приступить к созданию истинно цифровых баз данных по полиморфизму ДНК с возможностью поиска по ним, поскольку существующие довольно ущербны и не соответствуют времени. Нами предложен подход к ДНК-идентификации личности, основанный на принципе генетического штрих-кодирования. Можно с уверенностью утверждать, что альтернативы генетическим штрих-кодам не существует. После практически полного завершения секвенирования генома человека и продолжающегося исследования полиморфизма ДНК отдельных особей появились способствующие тому обстоятельства. Так, наибольшие отличия геномов разных людей заключаются в однонуклеотидных заменах, встречающихся в среднем через каждые 200-500 пн, составляющих до 85% всего полиморфизма ДНК и насчитывающих уже более 10 миллионов. Ввиду более надежного наследования в ряду поколений однонуклеотидные замены имеют преимущество перед повторяющимися элементами генома, таким как VNTR и STR, поскольку скорость мутаций для них составляет порядка 10-2-10"3 против 10'8 для снипов. При анализе снипов очень легко создать двухуровневую матрицу, данные которой будут цифровыми, поскольку представляют линейную запись чередующихся нулей и единиц, что является бинарным компьютерным форматом записи данных. Подавляющее число снипов биаллельны, однако имеются триаллельные и четырехаллельные снипы. Последних на 12.04.2006 известно 2209, что вполне достаточно для выбора нескольких десятков наиболее подходящих. Существует несколько причин для рассмотрения именно четырехаллельных однонуклеотидных замены. Во-первых, они обеспечивают заметно большее число возможных комбинаций, чем биаллельные. Во-вторых, оцифровываются более подходящим образом, обеспечивая формирование компактного гексадецимального формата записи, который кратен четырем знакам бинарного кода. В-третьих, даже при анализе биаллельных или триаллельных снипов нужно иметь в виду их потенциальную четырехаллельность. Следовательно, надо сразу брать в анализ четырехаллельные высокополиморфные снипы. Нам представляется, что генетический штрих-код человека должен заключаться в наборе последовательно расположенных 24-х ячеек однонуклеотидных замен, каждая из которых несет цифровую информацию в бинарном виде об обнаруживаемых в них нуклеотидах. С учетом возможной гетерозиготности локусов, разных типов ячеек может быть 10, что соответствует всем вариантам встречаемости двух нуклеотидов. Шесть из них (А и С), (А и G), (А и Т), (С и G), (С и Т), (G и Т) гетерозиготны, остальные четыре (А и А), (С и С), (G и G), (Т и Т) гомозиготны. Количество возможных комбинаций для 24 снипов составит гептиллион (Ю24). В настоящее время анализ снипов успешно ведется разными методами, однако продолжается разработка новых более производительных методов. Причина этого проста: со снипами связывают персональную медицину будущего, и фармацевтические компании вкладывают огромные деньги как в разработку новых методов, так и в обнаружение новых снипов и выявление связи последних со здоровьем человека. При этом серьезное внимание уделяется подходам, которые потенциально могут быть переведены в более производительный и дешевый биочиповый формат. Обилие методов анализа снипов свидетельствует о том, что не предложен метод, удовлетворяющий всем требованиям. Нами было уделено внимание этому вопросу и разработаны новые методы детекции снипов в передовом варианте в виде режима реального времени. Учитывая, что ДНК лигаза более требовательна к спариванию нуклеотидов в местах лигирования, чем ДНК полимераза к их комплементарности в месте удлинения праймера, ЛЦР-РВ может стать хорошей альтернативой аллель-специфичной ПЦР. Нами показано, что ЛЦР-РВ может с успехом использоваться в ДНК-диагностике при обнаружении различных инфекций, не уступая по чувствительности ПЦР. Технология циклирующей пробы после ее объединения нами с технологией молекулярного сигнального огня оказалась пригодной для анализа снипов, причем не только в режиме реального времени, но и в чиповом формате. Амплификация ДНК по типу катящегося кольца уже используется для детекции снипов, однако нами проведено удешевление данного подхода путем применения на стадии лигирования кольца дополнительного короткого олигонуклеотида с дискриминирующими нуклеотидами на 3'-конце. Это позволило сделать длинный олигонуклеотид общим для детекции всех вариантов нуклеотидов в конкретном снипе. Детекция наработки целевых продуктов в ходе изотермической амплификации велась нами в реальном времени с помощью рибобикона и технологии циклирующей пробы. Созданный нами прообраз базы данных по генетическим штрих-кодам, основанным на полиморфизме однонуклеотидных замен, сопряжен со специально написанной компьютерной программой для занесения информации по снипам в базу данных и поиску одинаковых генетических штрих-кодов по ней. Часть этой базы данных выделена под хранение информации по снипам из ДНК-следов, найденных на месте преступления, выявляемых в рамках ведения уголовных дел. Принятие Госдумой Федерального закона «О персональных данных» свидетельствует о решимости государства провести ДНК-паспортизацию населения. Вероятно, в новых паспортах строка личного кода будет заполненной. В первую очередь базы данных должны пополняться генетическими штрих-кодами лиц, чья деятельность связана с повышенным риском. Каждая страна должна иметь свою базу данных, которая будет частью мировой. Набор снипов для генетического штрих-кодирования населения планеты должен быть тщательно подобран и принят ведущими мировыми державами. Нам представляется, что банки данных по генетическим штрих-кодам должны быть доступны только соответствующим органам в своих странах. Генетическое штрих-кодирование всего народонаселения с одной стороны потребует значительных средств, а с другой будет представлять многомиллиардный бизнес. Можно прогнозировать, что в обозримом будущем потребуется проведение около 10 миллиардов анализов SNP-полиморфизма, а с учетом того, что всем новорожденным впредь будут присваиваться генетические штрих-коды, анализ однонуклеотидного полиморфизма ДНК останется востребован до тех пор, пока существует человечество. Стоимость одного анализа в настоящее время составит от 10 до 15 долларов для западных стран и 5-7 долларов для России. Средняя себестоимость будет составлять от 2 до 10 долларов США в зависимости от места изготовления соответствующего набора и метода анализа, на который он будет рассчитан. Нынешний анализ STR-полиморфизма для ДНК-идентификации личности одного индивида обходится в 30-50 долларов без учета амортизации и оплаты труда работающих. По оценкам специалистов каждый доллар, инвестированный в ДНК-криминалистику, сохраняет 35 долларов, которые были бы потрачены на социальные мероприятия, связанные с преступлением, без учета средств на само расследование. Научная библиотека диссертаций и авторефератов disserCat:
|
17 апреля 2019
Просмотров: 3 638
Другие новости по теме:
